UDP葡萄糖神經(jīng)酰胺葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(UGCG)ELISA檢測試劑盒技術(shù)資料

　　檢測原理：

　　UDP葡萄糖神經(jīng)酰胺葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(UGCG)ELISA檢測試劑盒采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附檢測方法。向預(yù)包被了抗體的微孔板中，加入標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣本，溫育后，加入生物素標(biāo)記抗體和過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素。經(jīng)過溫育和洗滌結(jié)合形成的免疫復(fù)合物，去除未結(jié)合的酶，然后加入顯色底物TMB。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的待測因子濃度呈正相關(guān)。最后，在450 nm處測定反應(yīng)孔樣品吸光度(OD)值，通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣本待測因子的濃度。

　　適用樣本：

　　血清、血漿、細(xì)胞培養(yǎng)上清液和組織等。

　　實(shí)驗(yàn)方法：

　　雙抗夾心法。

　　產(chǎn)品別名：

　　UGCG;GCS;GLCT1;UDP-glucose ceramide glucosyltransferase;ceramide glucosyltransferase;UDP-glucose:N-acylsphingosine D-glucosyltransferase;glucosylceramide synthase;glycosylceramide synthase;UDP葡萄糖神經(jīng)酰胺葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(UGCG)

　　試劑盒組分

　　ELISA酶標(biāo)板、標(biāo)準(zhǔn)品、生物素化抗體、濃縮HRP酶結(jié)合物、酶結(jié)合物稀釋液、生物素化抗體稀釋液、標(biāo)準(zhǔn)品&樣品稀釋液、濃縮洗滌液、底物溶液(TMB)、反應(yīng)終止液、封板覆膜

　　需自備物品

　　1.酶標(biāo)儀(450nm檢測波長濾光片，570nm或630nm校正波長濾光片) ;

　　2.洗板機(jī)(可調(diào)注液量，保證每孔350μl洗液而不溢出);

　　3.高精度單道加液器;

　　4.高精度多道加液器;

　　5.37℃恒溫箱;

　　6.低溫離心機(jī);

　　7.純凈水或蒸餾水。

　　操作步驟

　　1.從已平衡至室溫的密封袋中取出試驗(yàn)所需板條，未用的板條和干燥劑請放回鋁箔袋內(nèi)封存于2-8℃;

　　2.分別將標(biāo)本或不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品加入相應(yīng)孔中(100μl/孔)， 37℃孵箱孵育90分鐘;

　　3.棄掉板內(nèi)液體，洗板2次;

　　4.加入生物素化抗體工作液(100μl/孔)，37℃孵箱孵育60分鐘;棄掉板內(nèi)液體，洗板3次;

　　5.除空白孔外，加入酶結(jié)合物工作液(100μl/孔)。37℃孵箱，避光孵育30分鐘;棄掉板內(nèi)液體，洗板5次

　　6.加入TMB顯色工作液(包括空白孔)100μl/孔，37℃孵箱，避光孵育，當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)曲線高濃度的顏色較深，有明顯的顏色梯度的時(shí)候，即可終止。試驗(yàn)顯色反應(yīng)請勿超過30分鐘;

　　7.加入終止液(包括空白孔)100μl/孔，混勻后即刻測量OD(450nm)值(10分鐘內(nèi))。

　　8.計(jì)算標(biāo)本待測因子含量。

　　注意事項(xiàng)

　　1.試劑盒使用前請保存在2-8℃。除復(fù)溶后的標(biāo)準(zhǔn)品，其他成分不可凍結(jié)。

　　2.濃縮生物素化抗體，濃縮酶結(jié)合物體積小，運(yùn)輸中顛簸和可能的倒置，會(huì)使液體沾到管壁或瓶蓋。因此使用前請用手甩幾下或1000rpm離心1分鐘，以使附著管壁或瓶蓋的液體沉積到管底。

　　3.濃洗滌液可能會(huì)有結(jié)晶析出，稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶，使結(jié)晶溶解后再配制洗滌液。

　　4.實(shí)驗(yàn)過程中，凍干標(biāo)準(zhǔn)品為一次性使用，不得分裝。因其濃度較低，溶解兩小時(shí)候后，會(huì)迅速失活。

　　5.操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行，本試劑不同批號(hào)組分不得混用。

　　6.配制試劑時(shí)，要用旋渦混合儀混勻。加入孔內(nèi)的試劑，充分混勻?qū)y試結(jié)果尤為重要，最好使用微量振蕩器(使用頻率)，如無微量振蕩器，可在反應(yīng)前手工輕輕晃動(dòng)酶標(biāo)板1分鐘，例如做圓周動(dòng)作，使加入孔中的反應(yīng)液混勻。

　　7.實(shí)驗(yàn)用酶標(biāo)儀應(yīng)嚴(yán)格按使用說明書規(guī)范操作，并在使用前充分預(yù)熱。

　　8.酶免實(shí)驗(yàn)中標(biāo)準(zhǔn)品和樣本檢測時(shí)建議作復(fù)孔。

　　9.將不用的微孔板放進(jìn)原鋁箔袋中，置2-8℃保存。

　　10.顯色液對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。

　　11.超過使用有效日期的試劑盒不能應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)中。

　　12.試驗(yàn)結(jié)果判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn)，使用雙波長檢測時(shí)，波長應(yīng)該設(shè)置為450nm和630nm.

　　13.所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應(yīng)按生物廢棄物處理。終止液為2M硫酸，使用時(shí)必須注意安全。

　　14.各步驟加樣均應(yīng)使用加樣器，并經(jīng)常校準(zhǔn)其準(zhǔn)確性，以避免試驗(yàn)誤差。一次加樣時(shí)間控制在5分鐘內(nèi)，如標(biāo)本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。

　　15.每次試驗(yàn)測定的同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，做復(fù)孔。如標(biāo)本中待測物質(zhì)含量過高(樣本OD值大于標(biāo)準(zhǔn)品孔最高濃度的OD值)，請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)后再測定，計(jì)算時(shí)請最后乘以總稀釋倍數(shù)。

　　16.不能檢測含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的(HRP)活性。

　　17.以洗板機(jī)洗板時(shí)，每孔注液量不應(yīng)少于350μl, 注意檢查加樣頭是否堵塞。手工洗板時(shí)， 用帶紙屑的吸水材料應(yīng)慎重， 防止外源性過氧化物酶類似物或氧化還原物與顯色劑發(fā)生反應(yīng)。

　　18.用終止液終止反應(yīng)后，請于10分鐘內(nèi)讀取OD值。

　　19.進(jìn)行復(fù)孔實(shí)驗(yàn)時(shí)，結(jié)果計(jì)算一定要求平均值。

　　20.標(biāo)本溶血可能會(huì)有假陽性結(jié)果，因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項(xiàng)檢測。

　　21.試驗(yàn)時(shí)，應(yīng)該將加過樣品的板條放于密閉盒內(nèi)，并保持濕度約60%左右;

　　22.為保證恒溫箱內(nèi)的溫度為37℃，恒溫箱的溫度要經(jīng)常校準(zhǔn)。以確保實(shí)驗(yàn)溫度保持恒定。

　　精密度

　　批間差:CV%<10%;批內(nèi)差:CV%<8%

　　儲(chǔ)存

　　-20℃,短期4℃

　　有效期

　　12個(gè)月

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